Проект КП-06-М26/7 от 2018 г.
„Криогенен метод с ултралиофилизация за запазване на биологичната активност на екстракти от микробиални източници“
Ръководител: гл.ас. д-р Александър Вълчков
Колектив от ИКХТ: асистент докторант Николай Солаков
Членове от колектива на други научни организации: гл. ас. д-р Данаил Георгиев
Срок на изпълнение: 01.01.2019г. – 17.02.2021г.
Финансираща организация: Фонд “Научни изследвания”
Изследванията по проекта са насочени към оптимизиране на процеса сублимационно сушене, придобил популярност, като метод за запазване на жизнеспособността на микроорганизмите и трайността на хранителни продукти за продължителен период от време. В сравнение с други техники на сушене, процесът е икономически неизгоден, но когато акцентът е пренесен върху стабилизацията на продукта, а не върху дехидратацията, сушенето чрез лиофилизация остава предпочитан метод за запазване на чувствителни на топлина биопродукти. През последните години се търсят начини за усъвършенстване на този метод, с цел запазване в максимална степен на биологично активните вещества и полезните компоненти на лиофилизираните продукти от растителен, животински и микробен произход. Иновативен подход за подпомагане на сублимацията е включването на ултразвукови вълни, намаляващи времето за сушене и свързаните с това разходи за обработка чрез подобряване на преноса на топлина.
При разработване на проекта е изследвана възможността за оптимизиране процеса на изсушаване под вакуум и ниски температури на суровини, получени чрез ферментация с живи микроорганизми Обект на експериментите е щам продуцента Bacillus subtilis, култивиран в лабораторни условия.
С цел увеличаване количеството на продуцираните в културалната течност хитинолитични ензими (хитинази и хитозанази) от щам продуцента, е оптимизирана стандартната хранителна среда чрез промяна на въглеродния източник и добавяне на нативен белтъчен компонент и нативен компонент съдържащ хитин. Добавянето на такива компоненти води до увеличаване на ензимната активност на получения от културалната течност бистър разтвор. Установено е, че оптималната активна киселинност (pH) за продуциране на хитинолитични ензими (хитинази и хитозанази) от щам продуцента е в диапазона от 7 до 8. Проведени са експерименти за качествено и количествено определяне на ензимната активност на получените от щам продуцента хитиназни ензими. За качествено определяне на ензимна активност са използвани методи за микроскопско наблюдение и инструментален анализ чрез HPLC за регистриране на метаболити, получени от разграждането на хитина. За количествено определяне на ензимна активност са използвани спектофотометрични методи.
За активиране размножаването на бактериалните клетки от щам продуцента и постигане на максимален брой жизнеспособни клетки, към стандартната хранителна среда за култивиране са добавени нативни субстанции от лабораторно размножен мицел от висши медицински гъби (Cordyceps sinensis и Ganoderma lucidum) и индустриално получени екстракти от същите видове медицински гъби.
Използвани са два технологични подхода за постигане на бистър разтвор с висока ензимна активност. При първия подход, бистрият разтвор се отделя от културалната среда чрез центруфугиране. При втория подход е използван многостъпален метод на филтрация с плавно преминаване от микрофилтрация към ултрафилтрация, като отделените бистри разтвори от всеки етап са смесени заедно и по този начин са събрани максималното количество от продуцираните ензими. На тази основа са получени бистри разтвори с ензимна активност и мътен разтвор, съдържащ жизнеспособни клетки на щам продуцента. Проведени са експерименти за определяне на ензимната активност и броя на жизнеспособните клетки в получените разтвори.
Получените разтвори от културални среди, използвани в експерименти за култивиране на щам продуцента са подложени на лиофилизация по стандартен и оптимизиран чрез ултразвук метод (ултралиофилизация). При проведената ултралиофилизация са използвани няколко опорни честоти на звуковата вълна и е установено, че най-подходящата е 40 kHz. При нея се постига максимално количество реакции на резонанс с водата от разтвора и максимална ефективност за ускоряване процеса на изсушаване. При този процес, ензимът хитиназа може да бъде съхранен за период до 5 години, при стайна температура, а лиофилизираните микробни клетки могат да останат активни и да бъдат използвани многократно за продуциране на ензима хитиназа или в други биотехнологични процеси.
Допълнително е оценено и запазването на преживяемостта на микробните клетки и ензимната активност в пробите след лиофилизация. Получените резултати са сравнени с тези, получени от анализа на изходните разтвори. Резултатите от това сравнение подпомагат оценяването на ефективността на стандартния и оптимизирания метод на лиофилизация.
Направена е финансова обосновка на разходите за изсушаване по двата метода, включващи стандартна лиофилизация и ултралиофилизация, чрез която е направена оценка за ефективността на всеки отделен подход. Установено е, че чрез метода за ултралиофилизация се постига по-ниска себестойност на производствения процес на сушене и процесът е за предпочитане при обработка на ферментирали суровини.
Чрез разработване на новата технология за ултралиофилизация с използване на ултразвуков генератор с оптимална честота се обогатява експериментално технологичната практика на Институт по криобиология и хранителн технологии, свързана с оптимизиране процеса на сублимационно сушене. Получените лиофилизирани продукти се отличават със запазена висока концентрация на жизнеспособни клетки и биологично активни вещества.
Loginovska K., Maria Doneva, Nikolay Solakov, Alexandar Valchkov, Iliana Nacheva, 2020. Tracing the Development of Bacillus subtilis in Broth with Added Micelles and Extracts From Medicinal Mushrooms Higher, International Journal of Scientific Engineering and Applied Science (IJSEAS) – Volume-6, Issue-7, July 2020, 21-27, ISSN: 2395-3470, Импакт фактор – 4.214; http://ijseas.com/volume6/v6i7/ijseas20200703.pdf.
Solakov N., Alexandar Valchkov, 2020. Optimizing the biosynthesis of phytase and chitinase produced produced by Bacillus subtilis NBIMCC 2353 by changing the carbon and phosphorus sources and the composition of the nutrient medium, International Journal of Scientific Engineering and Applied Science (IJSEAS), Volume 06, Issue 11, November 2020, 40-47, ISSN: 2395-3470, Импакт фактор – 4.214; http://ijseas.com/volume6/v6i11/ijseas20201105.pdf.
Solakov N., Alexandar Valchkov, 2020.Optimization of the process of lyophilization of microbial culture of Bacillus subtilis NBIMCC 2353 by ultrasound, International Journal of Development Research, Vol. 10, Issue, 11, pp. 42163-42166, November, 2020, Импакт фактор – 7.012; https://www.journalijdr.com/sites/default/files/issue-pdf/20453.pdf.
Solakov N., Alexandar Valchkov, 2020.Ultrasonic lyophilization of an enzyme extract of Bacillus subtilis NBIMCC 2353, Journal of Chemical Technology and Metallurgy (под печат)